本发明的目的在于提供一种在将siRNA等核酸给予来自动物的细胞或动物时能使核酸高效地转运至细胞内、且毒性低、安全性高的核酸转运用载体、以及含有该载体与核酸的核酸转运用组合物。本发明通过组合(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)选自胆固醇及其衍生物中的至少一种及(C)脂肪族伯胺,将其配合,制备核酸转运用载体。另外,通过混合该核酸转运用载体与核酸来制备核酸转运用组合物。
1.一种siRNA转运用组合物,其特征在于,含有siRNA和siRNA转运用载体组合物,所述siRNA转运用载体组合物含有(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)选自胆固醇及其衍生物中的至少一种及(C)脂肪族伯胺,其中,成分(A)∶成分(B)∶成分(C)的摩尔比为6~9∶1~4∶1。
2.如权利要求1所述的siRNA转运用组合物,其中,成分(A)为酰基部分的碳原子数为4~23的二酰基磷脂酰胆碱。
3.如权利要求1或2所述的siRNA转运用组合物,其中,成分(B)为胆固醇。
4.如权利要求1所述的siRNA转运用组合物,其中,成分(C)为碳原子数为10~20的烷基胺。
5.如权利要求1所述的siRNA转运用组合物,其中,成分(A)是选自二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱中的至少一种,成分(B)为胆固醇,且成分(C)为硬脂胺。
6.如权利要求1所述的siRNA转运用组合物,其中,所述siRNA转运用载体组合物是由成分(A)~(C)形成脂质体膜的脂质体制剂。
7.如权利要求1所述的siRNA转运用组合物,是脂质体制剂。
8.一种siRNA导入方法,包括通过使权利要求1所述的siRNA转运用组合物与细胞接触,使siRNA导入培养细胞或从生物体分离得到的细胞内的步骤。
9.含有(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)选自胆固醇及其衍生物中的至少一种及(C)脂肪族伯胺的组合物在制备siRNA转运用组合物中的应用,其中,成分(A)∶成分(B)∶成分(C)的摩尔比为6~9∶1~4∶1。技术领域
本发明涉及一种在将核酸给予来自动物的细胞或生物时能将核酸高效地转运至细胞内的、毒性低且安全性高的核酸转运用载体组合物、以及核酸转运用组合物。
背景技术
近年,随着生物技术的发展,已经发现了多种在细胞内发挥生理活性功能的核酸。例如,已知siRNA(smallxa0interferingxa0RNA:小干涉RNA)可引起存在于细胞内的靶基因的mRNA分解,阻碍靶基因表达(RNAxa0interference:RNA干涉)。由RNA干涉产生的阻碍靶基因表达的功能对缓解或治疗由特定的基因或基因组的异常表达而引起的疾病有用,故人们期待将siRNA开发用作治疗药。但是,为了将以siRNA为首的核酸用作治疗药,重要的是使siRNA在靶细胞内发挥功能,因此,确立使核酸有效地转运至靶细胞内的技术必不可少。作为将外源性核酸分子或基因转运至细胞内的技术,已知有利用载体(运载体)的技术。运载体包括病毒性运载体和非病毒性运载体。病毒性运载体显示出高基因导入效率,但病原性、免疫原性、细胞毒性等在安全性方面存在许多不明之处。因此期望开发安全性更高的非病毒运载体。目前为止,作为促进siRNA等核酸向细胞内转运的非病毒性核酸转运用载体,例如专利文献1中公开了一种具有特定结构的阳离子性脂质。但是,专利文献1中公开的阳离子性脂质具有在给予培养细胞或生体时呈现毒性的缺点。另外,专利文献2中,作为毒性较低、可将siRNA转运至细胞内的载体组合物,公开了含有两亲性化合物及聚阳离子的组合物。但是,即使是专利文献2中公开的组合物,在将充分量的siRNA导入细胞内时,由于其对细胞的毒性变得明显,所以在安全性方面依然存在问题。以上述现有技术为背景,人们期待开发出毒性低、能够使以siRNA为代表的核酸高效率地转运到细胞内的核酸转运用载体组合物。专利文献1:特表2002-529439号公报专利文献2:特表2005-508394号公报
发明内容
因此,本发明的目的在于解决上述现有技术中存在的问题。具体而言,本发明的目的在于提供一种在将siRNA等核酸给予来自动物的细胞或动物时能使核酸高效地转运至细胞内,且显示出低毒性和高安全性的核酸转运用载体组合物;并提供一种含有该载体组合物和核酸的核酸转运用组合物。另外,本发明的其他目的在于提供一种能以高安全性将核酸高效地转运至细胞内的、向细胞内导入核酸的方法。本发明人等为了解决上述问题进行了潜心研究,结果发现组合含有(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)胆固醇及/或其衍生物及(C)脂肪族伯胺的组合物,毒性低、显示出高安全性,且能有效地使核酸转运至细胞内,作为核酸转运用载体是有用的。另外发现,特别是通过将含有上述成分(A)~(C)的组合物制成脂质体形态进行使用,能够同时具有更加优异的安全性及核酸导入性。本发明是基于上述发现,通过进一步反复研究而完成的。即,本发明提供下述发明:项1、一种核酸转运用载体组合物,其特征在于,含有(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)选自胆固醇及其衍生物中的至少一种及(C)脂肪族伯胺。项2、如项1所述的核酸转运用载体组合物,其中,成分(A)为酰基部分的碳原子数为4~23的二酰基磷脂酰胆碱。项3、如项1或2所述的核酸转运用载体组合物,其中,成分(B)为胆固醇。项4、如项1所述的核酸转运用载体组合物,其中,成分(C)为碳原子数为10~20的烷基胺。项5、如项1所述的核酸转运用载体组合物,其中,成分(A)是选自二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱中的至少一种,成分(B)为胆固醇,且成分(C)为硬脂胺。项6、如项1所述的核酸转运用载体组合物,其中,成分(A)∶(B)成分∶(C)成分的摩尔比为5~9∶1~5∶1。项7、如项1所述的核酸转运用载体组合物,是siRNA转运用载体。项8、如项1所述的核酸转运用载体组合物,是由成分(A)~(C)形成脂质体膜的脂质体制剂。项9、一种核酸转运用组合物,含有核酸及项1所述的核酸转运用载体组合物。项10、如项9所述的核酸转运用组合物,其中,核酸为siRNA。项11、如项9所述的核酸转运用组合物,是脂质体制剂。项12、一种核酸导入方法,包括通过使项9所述的核酸转运用组合物与细胞接触,使核酸导入细胞内的步骤。项13、如项12所述的核酸导入方法,其中,细胞为培养细胞、从生物体分离得到的细胞或存在于生物体内的细胞。项14、含有(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)选自胆固醇及其衍生物中的至少一种及(C)脂肪族伯胺的组合物在制备核酸转运用载体中的应用。项15、如项14所述的应用,其中,核酸转运用载体为siRNA转运用载体。本发明的核酸转运用载体组合物及核酸转运用组合物具有下述优点,即,能够有效地将核酸转运至细胞内,在细胞内能够有效地发挥核酸的有用功能,且毒性低、安全性高。因此,上述核酸转运用载体组合物及核酸转运用组合物对治疗由导入核酸引起的各种疾病、特别是治疗对用低分子化合物等难以治疗的难治性疾病有用。另外,特别是,由于本发明的核酸转运用载体组合物及核酸转运用组合物能有效地抑制作为siRNA副作用的干扰素的表达诱导,所以特别适用于将siRNA导入细胞内。进而,本发明的核酸转运用组合物可进行冻干处理,因此还具有可在冻干状态下保存的优点。
附图说明
[图1]为表示试验例1的结果,即评价核酸转运用组合物的细胞安全性的结果的图。[图2]为表示评价在试验例2中将各核酸转运用组合物中的siRNA导入细胞内的结果的图。图2的纵轴表示每1个细胞的荧光强度的平均值。[图3]为表示评价在试验例2中在核酸转运用组合物中改变核酸转运用载体的构成脂质(DSPC、胆固醇和硬脂胺)浓度、将siRNA导入细胞内的结果的图。[图4]为表示评价在试验例3中含有siRNA的核酸转运用组合物的干扰素诱导抑制的结果的图。
具体实施方式
以下,详细地说明本发明。核酸转运用载体本发明的核酸转运用载体组合物的特征在于,含有(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)胆固醇及/或其衍生物及(C)脂肪族伯胺。本发明的核酸转运用载体组合物可以用作用于将核酸转运(导入)细胞内的核酸载体。本发明的核酸转运用载体组合物适用的核酸只要是必需转运至细胞内的核酸即可,对核酸的种类及结构没有特别限定。作为该核酸的具体例,可以举出siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、cDNA、miRNA(微RNA)、核酶、反义寡核苷酸、诱饵寡核苷酸、质粒DNA、肽核酸、三链形成性寡核苷酸(Triplexxa0Formingxa0Oligonucleotide,TFO)、适体(aptamer)、基因等。其中,本发明的核酸转运用载体组合物具有抑制作为siRNA的副作用的干扰素的表达诱导的有利特征,因此在将siRNA向细胞内转运方面特别有用。本发明的核酸转运用载体适用的核酸可以是来自人、动物、植物、细菌、病毒等的核酸,另外,也可以是通过化学合成制备得到的核酸。进而,上述核酸可以是单链、双链或三链中的任一种,并且对其分子量也没有特别限定。另外,在本发明中,核酸也可以是被化学物质、酶或肽修饰的核酸。在本发明中,核酸可以单独使用一种,另外,也可以适当地组合两种以上进行使用。作为本发明的核酸转运用载体组合物中使用的二酰基磷脂酰胆碱(以下有时也记作“成分(A)”),只要药理学上允许即可,没有特别限定,例如可以举出酰基部分的碳原子数为4~23的二酰基磷脂酰胆碱。需要说明的是,构成该二酰基磷脂酰胆碱的两个酰基的碳原子数可以相同也可以不同。作为本发明中使用的二酰基磷脂酰胆碱的具体例,可以举出二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰棕榈酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱、二丁酰磷脂酰胆碱、二己酰磷脂酰胆碱、二庚酰磷脂酰胆碱、二癸酰磷脂酰胆碱、二苯二甲酰磷脂酰胆碱(diphthanoylphosphatidylcholine)、二月桂基磷脂酰胆碱、二花生酰磷脂酰胆碱、二(二十一烷酰基)磷脂酰胆碱、二芥酸酰磷脂酰胆碱、二花生四烯酸酰磷脂酰胆碱及双(二十三烷二酰基)磷脂酰胆碱(bis(tricosadinoyl)phosphatidylcholine)等。其中,优选可以举出酰基部分的碳原子数为12~18的二酰基磷脂酰胆碱;更优选举出二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰棕榈酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰硬脂酰磷脂酰胆碱和棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱等酰基部分的碳原子数为13~17的二酰基磷脂酰胆碱;特别优选举出二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱;最优选举出二硬脂酰磷脂酰胆碱。上述二酰基磷脂酰胆碱可以单独使用一种,或者也可以组合两种以上使用。作为本发明的核酸转运用载体组合物中使用的胆固醇及/或其衍生物(以下有时也记作“成分(B)”),只要药理学上允许即可,没有特别限定。所谓胆固醇的衍生物,是指具有胆固醇骨架的阳离子性脂质,具体而言可以举出3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、3β-[N’,N’,N’-三甲基氨基乙烷]碘化胆固醇(TC-Chol)、(N’,N-双胍乙基氨基乙烷)氨基甲酰-胆固醇(bis(guanidinium)-tren-cholesterose)(BGTC)、N-胆甾烯基氧基羰基-3,7-二氮杂壬烷-1,9-二胺、β-丙氨酸-二乙醇胺-胆固醇、N⁴-精胺胆固醇氨基甲酸酯(GL-67;N⁴-sperminexa0cholesterylxa0carbamate)、N[N⁴-3-氨基丙基亚精胺]胆固醇氨基甲酸酯(GL-78;N[N⁴-3-aminopropylspermidine]cholesterylxa0carbamate)、N⁴-精胺胆固醇甲酰胺(GL-90;N⁴-sperminexa0cholesterylxa0carboxamide)、N¹,N⁸-双(精氨酸甲酰胺)-N⁴-亚精胺胆固醇氨基甲酸酯(GL-95;N¹,N⁸-Bis(arginincxa0carboxamide)-N⁴-spermidinexa0cholesteryxa0carbamate)、N-[N¹,N⁴,N⁸-三(3-氨基丙基)亚精胺]胆固醇氨基甲酸酯(GL-96;N-[N¹,N⁴,N⁸-Tris(3-aminopropyl)spermidine]cholesterylxa0carbamate)。在本发明中,作为优选的成分(B),可以举出胆固醇。本发明作为成分(B)可以单独使用胆固醇及其衍生物中的一种,或者也可以组合两种以上使用。作为本发明的核酸转运用载体组合物中使用的脂肪族伯胺(以下有时也记作“成分(C)”),只要药理学上允许即可,没有特别限定,例如可以举出烷基部分的碳原子数为10~20的烷基胺。作为本发明中使用的脂肪族伯胺的具体例,可以举出月桂胺、肉豆蔻胺、棕榈胺、硬脂胺、油胺、癸酰胺、苯二甲酰胺(phthanoylamine)等。其中,优选举出烷基部分的碳原子数为12~18的烷基胺;更优选举出硬脂胺、油胺和棕榈酰胺,特别优选举出硬脂胺。上述脂肪族伯胺可以单独使用一种,或者也可以组合两种以上使用。本发明的核酸转运用载体组合物可以组合含有上述成分(A)~(C),从通过采用下述组合方案进一步提高核酸向细胞内的转运效率及低毒性的观点考虑,优选以下列举的组合:(A)酰基部分的碳原子数为4~23的二酰基磷脂酰胆碱、(B)胆固醇及/或其衍生物以及(C)碳原子数为10~20的烷基胺的组合;更优选(A)二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱及/或二硬脂酰磷脂酰胆碱、(B)胆固醇、以及(C)硬脂胺的组合。另外,在本发明的核酸转运用载体组合物中,对成分(A)~(C)的配合比率,没有特别限定,例如可以举出成分(A)∶成分(B)∶成分(C)的摩尔比为5~9∶1~5∶1,优选为6~9∶1~4∶1,更优选为7~8∶2~3∶1。通过满足上述比率,可以进一步提高核酸向细胞内的转运效率及低毒性。另外,作为相对于本发明的核酸转运用载体的总量的成分(A)~(C)的总量,例如可以举出1~100重量%、优选为20~90重量%、更优选为30~70重量%。本发明的核酸转运用载体组合物除了上述成分(A)~(C)之外还可以含有其他阳离子性脂质。作为上述阳离子性脂质,具体而言可以举出角鲨胺(Squalamine)、3a,7a,12a-三(3-氨基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N,N-双(3-氨基丙基)胺(3a,7a,12a-Tris(3-aminopropoxy)-5β-cholan-24-(N,N-bis(3-aminopropyl)amine)、3a,7a,12a-三(3-氨基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N-(N-(3-氨基丙基))-3-氨基丙基)-胺(3a,7a,12a-Tris(3-aminopropoxy)-5b-cholan-24-(N-(N-(3-aminopropyl))-3-aminopropyl)-amine)、3a,7a,12a-三(3-叠氮基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N,N-双(2-氰基乙基)胺)(3a,7a,12a-Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan-24-(N,N-bis(2-cyanoethy1)amine))、3a,7a,12a-三(3-叠氮基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N-(苄氧基羰基)-N-(羟基丙基)-胺)(3a,7a,12a-Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan-24-(N-(benzyloxycarbonyl)-N-(3-hydroxypropyl)-amine))等甾族化合物结合的阳离子性脂质;伞状精胺复合体(Umbrella-sperminexa0conjugates)等胆酸结合的阳离子性脂质;甾醇糖苷结合的阳离子性脂质;甾类皂苷结合的阳离子性脂质;二甲基二(十八烷基)溴化铵盐(DDAB)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷甲基硫酸盐、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷、N-(1-(2,3-双(油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基铵盐酸盐(DOTMA)、二肉豆蔻酰基氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵盐(DMRIE)、二油酰基氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵(DORIE)、二甲基(二)十二烷基溴化铵、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-(二)十二烷基-D-谷氨酰胺盐酸盐、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-O,O’-双-(1H,1H,2H,2H-全氟癸基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、O,O’-二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、甲基烯丙基二(十二烷基)溴化铵、N-{p-(w-三甲基铵基丁基氧基)-苯甲酰基}-二(十二烷基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、9-(w-三甲基铵基丁基)-3,6-双(十二烷酰基)咔唑溴化物、二甲基二(十八烷基)铵盐酸盐、N-w-三甲基铵基十二烷酰基-二(十六烷基)-D-谷氨酰胺溴化物、N-{p-(w-三甲基铵基己基氧基)-苯甲酰基}-二(十四烷基)-L-谷氨酰胺溴化物、p-(w-三甲基铵基癸基氧基)-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-1-0810)、p-{w-(b-羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-3-0810)、O,O’,O”-三(十二烷酰基)-N-(w-三甲基-铵基癸酰基)-三(羟基甲基)氨基甲烷溴化物盐(TC-1-12)、1,2-二月桂基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1-棕榈酰-2-油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱等季铵盐型阳离子性脂质等。在本发明中,含有除成分(A)~(C)之外的其他阳离子性脂质时,作为该阳离子性脂质的比例,只要不影响本发明的效果即可,没有特别限定,可以举出下述比例,即相对于100重量份上述成分(A)~(C)的总量,该阳离子性脂质为1~10重量份、优选为2~8重量份、更优选为4~6重量份。进而,根据需要本发明的核酸转运用载体组合物也可以含有油性基剂。配合油性基剂,利用其特性,由此能控制核酸转运用载体组合物的核酸导入效率。例如通过配合油性基剂调节核酸转运用载体组合物的比重,可以控制细胞与核酸转运用载体组合物的接触性,改善体外的导入效率。另外,例如通过配合具有温度感受性功能的基剂作为油性基剂,能够在规定的温度条件下使核酸载体组合物的芯破碎,从而诱发细胞表面的波动,提高核酸的导入效率。进而,例如通过配合具有外部刺激破碎性的基剂作为油性基剂,可以通过外部刺激使核酸载体组合物的芯破碎,从而诱发细胞表面的波动,提高核酸的导入效率。作为本发明的核酸转运用载体组合物中配合的油性基剂,例如可以举出全氟化碳、全氟戊烷、溴代全氟辛烷、全氟己烷、全氟三丁基胺、大豆油、精制大豆油、氢化大豆油、大豆油非皂化物、角鲨烯、蓖麻油、丁香油、失水山梨醇三油酸酯、松节油、红花油、红花油脂肪酸、油酸、椰子油、菜子油、杂醇油、橄榄油、亚麻仁油、芝麻油、叶绿素油、巴豆油、佛手油、雪松油、橙油、茴香油、桉树油、玉米油、熏衣草油、香马郁兰油、柠檬油、棉籽油、蛋黄油、玫瑰花油、松油、杏仁油、花生油、山茶油、白樟油、春黄菊油、桂皮油、薄荷油、酯化玉米油、生姜油、罗马春黄菊油、蛇油、留兰香油、向日葵油、可可脂、小麦胚芽油、氧化锌油、氢化油、氢化植物油、轻质液体石蜡、液体石蜡、中链脂肪酸三甘油酯、貂油、苦橙油、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、聚氧乙烯氢化蓖麻油100、聚氧乙烯氢化蓖麻油20、聚氧乙烯氢化蓖麻油40、聚氧乙烯氢化蓖麻油5、聚氧乙烯氢化蓖麻油50、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蓖麻油聚烃氧酯35、操作油等。在上述油性基剂中,全氟戊烷具有温度感受性、具有在29.5°C下通过沸腾气化的特性。另外,全氟己烷、溴代全氟辛烷及全氟三丁基胺具有下述特性,即具有外部刺激破碎性,在由超声波照射产生的刺激等来自外部的刺激作用下,使载体组合物的芯产生空腔,使其破碎。当核酸转运用载体组合物含有该油性基剂时,作为该油性基剂的比例,只要不妨碍本发明的效果即可,没有特别限定,例如可以为下述比例,即相对于100重量份上述成分(A)~(C)的总量,该油性基材为0.1~50重量份、优选为1~30重量份、更优选为5~20重量份。进而,根据需要本发明的核酸转运用载体组合物中也可以含有膜融合性脂质(辅助脂质)。通过含有上述膜融合性脂质,可以进一步提高核酸向细胞内的转运效率。作为上述膜融合性脂质,例如可以举二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰胆碱、反式磷脂酰基磷脂酰基乙醇胺、1,2-双(10,12-二十三烷二酰基)-磷酸乙醇胺、1,2-二反油酰基磷酸乙醇胺、1,2-二(十六烷基)磷酸乙醇胺、1,2-二己酰基磷酸乙醇胺、1,2-二月桂酰基磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺、1,2-二棕榈油酰基磷酸乙醇胺、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1,2-二植烷酰磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-(10,12-二十三烷二酰基)磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、N,N-二甲基-1,2-二油酰基磷酸乙醇胺、N,N-二甲基-1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷酰基-1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷酰基-1,2-二油酰基磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-乳糖、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酸盐、二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酸盐、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺苯基)丁酰胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺苯基)丁酸盐]、N-甲基-1,2-二油酰基磷酸乙醇胺、N-甲基-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸盐、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸盐、N-(琥珀酰)-1,2-二油酰基磷酸乙醇胺、N-(琥珀酰)-1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺等。其中,在本发明的核酸转运用载体组合物中优选使用二油酰基磷脂酰乙醇胺。当核酸转运用载体组合物含有该膜融合性脂质时,作为该膜融合性脂质的比例,只要不妨碍本发明的效果即可,没有特别限定,可以举出下述比例,即相对于100重量份上述成分(A)~(C)的总量,该膜融合性脂质为1~500重量份、优选为10~250重量份、更优选为25~100重量份。根据使用形态,本发明的核酸转运用载体组合物可以含有等渗剂、赋形剂、稀释剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂、保存剂等各种添加剂;精制水、糖水溶液、缓冲液、生理盐水、高分子水溶液、RNasexa0free水等水性载体。上述添加剂和水性载体的配合量可以根据核酸转运用载体的使用形态适当地设定。本发明的核酸转运用载体组合物的形态只要能够包含成为转运至细胞内的对象的核酸即可,没有特别限定,优选脂质体形态。将本发明的核酸转运用载体组合物制成脂质体形态时,上述成分(A)~(C)及根据需要添加的其他脂质形成脂质体膜。制成脂质体形态时,可以为小单层脂质体(smallxa0unilamellar.vesicles:SUV)、大单层脂质体(largexa0unilamellarxa0vesicles:LUV)、及多层脂质体(multilamellarvesicles:MLV)中的任一种。另外,对于其粒径,可以根据转运对象的细胞种类等适当地设定,例如可以举出为SUV时粒径为20~100nm、为LUV时粒径为200~1000nm、为MLV时粒径为400~3500nm左右。脂质体的粒径是根据动态光散射法而测定得到的。脂质体的制备及其粒径的调节按照本领域公知的方法实施。即,可以使用含有上述成分(A)~(C)的油相和水相(水性载体),通过薄膜法、逆向蒸发法、醚注入法、表面活性剂法、加热法等形成脂质体。另外,可以通过挤压法、Frenchxa0press法、均质化法等调节粒径。本发明的核酸转运用载体组合物如下配制:混合上述成分(A)、成分(B)及根据需要混合的其他成分,根据目的形态适当地制剂化。核酸转运用组合物本发明的核酸转运用组合物含有上述核酸转运用载体组合物和核酸。即,该核酸转运用组合物用于将在该组合物内含有的核酸导入作为转运对象的细胞内。核酸转运用载体组合物为脂质体形态时,在该核酸转运用组合物中,核酸可以以被封入在脂质体的内水相中的状态存在,或也可以以通过离子键或疏水键键合在脂质体膜的内侧或外侧的状态存在。另外,核酸转运用载体组合物为脂质体以外的形态时,在该核酸转运用组合物中,只要核酸与核酸转运用载体组合物的配合成分通过离子键或疏水键形成复合体即可。本发明的核酸转运用组合物通过混合上述核酸转运用载体组合物与核酸制成所期望的形态,或以任意顺序混合核酸及上述核酸转运用载体组合物的配合成分制成所期望的形态而进行制备。在本发明的核酸转运用组合物中,作为核酸与核酸转运用载体组合物的配合比率,根据使用的核酸或核酸转运用载体的种类或为核酸转运对象的细胞的种类等而不同,例如可以举出下述比例,即相对于核酸转运用载体组合物中所含的成分(A)~(C)的总量100重量份,核酸为1.0×10^-5~1.0重量份、优选为1.0×10^-4~1.0×10^-1重量份、更优选为1.0×10^-3~1.0×10^-2重量份。另外,作为核酸转运用组合物中含有的成分(A)~(C)的总量,相对于该组合物的总量,例如可以举出10~90重量%、优选为30~80重量%、更优选为40~60重量%。根据其使用形态,本发明的核酸转运用组合物可以含有等渗剂、赋形剂、稀释剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂、保存剂等各种添加剂;精制水、葡萄糖水溶液、缓冲液、生理盐水等水性载体。上述添加剂和水性载体的配合量可以根据核酸转运用组合物的使用形态而适当地设定。在本发明中,作为转运核酸的细胞,可以举出培养细胞、从生物体中萃取的细胞(包括株化的细胞)、存在于人等生物体内的细胞等。作为本发明的核酸转运用组合物的使用状态,只要能使适量的该核酸转运用组合物与作为核酸导入对象的细胞接触即可,没有特别限定。例如,向人等生物体内的细胞中转运核酸时,例如可以举出向组织中直接注入;向静脉、皮下、肌肉、腹腔、眼内、消化器官内、牙内等注射;从鼻腔、口腔、肺等吸入给予;口服给予;通过皮肤的透皮给予;及通过口腔粘膜、阴道粘膜、眼粘膜、直肠粘膜、子宫粘膜的经粘膜给予等。另外,在向培养细胞或从生物体萃取的细胞中转运核酸时,可以举出培养时将适量的核酸转运用组合物预先加到培养基中,在该状态下培养细胞的方法。需要说明的是,向培养细胞或从生物体萃取的细胞中转运核酸时,即使在血清存在下也可以将核酸转运至细胞内。另外,相对于作为核酸导入对象的细胞,本发明的核酸转运用组合物的使用量,根据使用的核酸种类、该核酸转运用组合物的种类、作为对象的细胞的种类等适当地设定。例如核酸的转运对象为人体内的细胞时,对期待通过给予核酸得到治疗效果的患者可以给予治疗有效量的本发明的核酸转运用组合物。实施例以下,基于实施例等详细地说明本发明,但本发明并不限定于此。需要说明的是,在以下实施例等中,二硬脂酰磷脂酰胆碱记作“DSPC”、二棕榈酰磷脂酰胆碱记作“DPPC”、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱记作“DMPC”。另外,在以下试验例1及2中使用GL3-siRNA(相对于靶向萤火虫荧光素酶的siRNA;Dharmacon公司,Boulder,CO,USA;有意义:5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT、反义:5’-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT)作为siRNA。另外,在试验例3中,使用人MMP-9-siRNA(Samchullyxa0Pharm.Co.,Ltd,Korea;有意义5’-CCAACUAUGACCAGGAUAAdTdT-3’,反义:5’-UUAUCCUGGUCAUAGUUGGdTdT-3’)作为siRNA。实施例1含有DSPC的核酸转运用载体组合物的配制称量DSPC、胆固醇和硬脂胺使其以摩尔比为DSPC∶胆固醇∶硬脂胺=7∶3∶1,用茄型瓶使之溶解于氯仿中。用旋转蒸发仪使之减压干燥,形成脂质薄膜。向其中加入DEPC-处理水(Ambion公司制;Rnasexa0free水)使以DSPC浓度计为30mg/mL后,用挤压机通过100nm孔径的膜来调节粒径,制备为阳离子性脂质体形态的核酸转运用载体组合物。实施例2含有DPPC的核酸转运用载体组合物的制备除使用DPPC代替DSPC之外,采用与上述实施例1同样的方法,制备阳离子性脂质体形态的核酸转运用载体组合物。实施例3含有DMPC的核酸转运用载体组合物的制备除使用DMPC代替DSPC之外,采用与上述实施例1同样的方法,制备阳离子性脂质体形态的核酸转运用载体组合物。实施例4含有DSPC的核酸转运用组合物的制备使用利用DEPC-处理水(Ambion公司制;Rnasefree水)将20×Tris-EDTA(TE)缓冲液(Invitrogen公司制)稀释20倍的溶液,配制以2μM的浓度含有siRNA的溶液(siRNA溶液)。然后,等量混合实施例1的核酸转运用载体组合物与siRNA溶液,形成脂质体复合物(复合体),制备核酸转运用组合物。实施例5含有DPPC的核酸转运用组合物的制备使用以DEPC-处理水(Ambion公司制;Rnasefree水)将20×Tris-EDTA(TE)缓冲液(Invitrogen公司制)稀释20倍的溶液,配制以2μM的浓度含有siRNA的溶液(siRNA溶液)。然后,等量混合实施例2的核酸转运用载体组合物与siRNA溶液,形成脂质体复合物(复合体),配制核酸转运用组合物。实施例6含有DMPC的核酸转运用组合物的配制使用利用DEPC-处理水(Ambion公司制;Rnasefree水)将20×Tris-EDTA(TE)缓冲液(Invitrogen公司制)稀释20倍的溶液,配制以2μM的浓度含有siRNA的溶液(siRNA溶液)。然后,等量混合实施例3的核酸转运用载体组合物与siRNA溶液,形成脂质体复合物(复合体),配制核酸转运用组合物。试验例1细胞安全性的评价试验利用MTS试验法进行评价。MTS试验利用Promega公司制的“CellTiter96xa0Aqueousxa0Onexa0Solutionxa0Cellxa0Proliferationxa0Assay”进行。具体而言,在96孔板上将A594细胞(ATCC,USA)以3.16×10⁴cells/孔接种在200μL含有10容量%胎牛血清(FBS)的Dulbecco’sxa0Modificationxa0ofEagle’s培养基(DMEM)中,在37°C下培养24小时。用Hank’s缓冲盐溶液(HBSS)洗涤3次后,将培养基更换为不含FBS的DMEM,向每1孔中分别加入20μL上述实施例4~6的核酸转运用组合物,在37°C、5%CO₂条件下培养4小时。然后,将孔中的培养上清液更换为含有10容量%FBS的DMEM,进一步在37°C、5%CO₂条件下培养20小时。然后,向各孔中加入20μLxa0MTS(甲烷硫代磺酸酯)试剂及100μL含有10容量%FBS的DMEM培养基,培养2小时后,测定在492nm处的吸光度,计算细胞存活率(cellxa0viability)。需要说明的是,细胞存活率是以不添加核酸转运用组合物在上述条件下培养时测定的490nm处的吸光度为100%计算得到的。所得结果示于图1。由图1可知,实施例4~6的核酸转运用组合物均显示出低细胞毒性、高安全性。特别是,能够确认使用DSPC或DPPC作为二酰基磷脂酰胆碱的核酸转运用组合物(实施例4或5)的安全性明显高。试验例2xa0siRNA向细胞内的转运效率的评价试验通过使用流式细胞仪测定标记在siRNA上的FITC的荧光强度来评价细胞内导入。需要说明的是,本试验使用的核酸转运用组合物是使用在siRNA上预先进行FITC标记的siRNA配制得到的。具体而言,在24孔板上将A594细胞(ATCC,USA)以5×10⁵cells/孔接种至500μL含有10容量%FBS的DMEM中,在37°C、5%CO₂条件下培养24小时。用HBSS洗涤3次后,将培养基更换为不含FBS的DMEM,进一步向每1孔中分别加入0.05mL上述实施例4~6的核酸转运用组合物,在37°C、5%CO₂条件下培养4小时。然后,将孔中的培养上清液更换为含有10容量%FBS的DMEM,进一步在37°C、5%CO₂条件下培养20小时。将各孔用HBSS洗涤1次后,加入0.2mLxa0CellScrubBuffer(GeneTherapyxa0Systems,Inc.制),在37°C、5%CO₂条件下培养15分钟。进而,用HBSS洗涤2次后,使用胰蛋白酶剥取附着于孔底部的细胞,通过离心分离回收细胞,使所得细胞悬浮于HBSS中。使上述悬浮液通过41μm孔径的膜。用流式细胞仪测定加入核酸转运用组合物2小时后及24小时后的细胞的荧光强度。另外,作为对照,使用下述对照用核酸转运用组合物,与上述相同地测定细胞的荧光强度,所述对照用核酸转运用组合物如下制备:以容量比1∶1混合用OptiMEM培养基将市售的常用作基因运载体的Lipofectaminexa02000^TM(Invitrogen公司制)稀释至0.1mg/mL的溶液、和用TE缓冲液以2μM的浓度稀释siRNA的siRNA溶液。所得结果示于图2。由上述结果可以确认,为实施例4~6的核酸转运用组合物的任意一种的情况下,siRNA均能被高效地导入细胞内。特别是,也能够表明使用DSPC或DMPC作为二酰基磷脂酰胆碱的核酸转运用组合物(实施例4及6),在加入2小时后siRNA向细胞内的导入与市售的常用作基因运载体的Lipofectamine^TMxa02000相比较显著,具有速效性优异的有利特征。另外,使用DSPC、胆固醇和硬脂胺(以摩尔比计DSPC∶胆固醇∶硬脂胺=7∶3∶1,以下,统称为“核酸转运用载体的构成脂质”),基于实施例1所述的方法制备DSPC的浓度为7.5~30mg/mL的核酸转运用载体。然后,等量混合该核酸转运用载体与含有200nM的siRNA的TE缓冲液,形成脂质体复合物(复合体),制备核酸转运用组合物。使用上述制备得到的核酸转运用组合物,采用与上述同样的方法评价siRNA向细胞内的导入。结果示于图3。结果表明,如果改变核酸转运用载体的构成脂质的浓度,则利用核酸转运用组合物向细胞内导入核酸的量相应地发生变化。另外,表明核酸转运用载体构成脂质为任何浓度时,导入siRNA的量在加入24小时后的值低于在加入2小时后的值,并且在加入24小时后siRNA开始消失。即,由上述结果还可以确认,通过组合DSPC、胆固醇和硬脂胺用作核酸转运用载体,可以在加入2小时后的短时间内将siRNA转运到细胞内,速效性优异。试验例3干扰素诱导抑制的评价试验在24孔板上将A594细胞(ATCC,USA)以5×10⁵cells/孔接种在500μL含有10容量%FBS的DMEM中,在37°C、5%CO₂条件下培养24小时。用HBSS洗涤3次后,向各孔中加入450μL不含FBS的DMEM培养基,再向各孔中加入50μL上述实施例4的核酸转运用组合物,在37°C、5%CO₂条件下培养4小时。然后,将孔中的培养上清液更换为含有10容量%FBS的DMEM,进一步在37°C、5%CO₂条件下培养20小时。进而,用HBSS洗涤3次后,使用胰蛋白酶剥取附着于孔底部的细胞,通过离心分离回收细胞。使用Rneasyxa0Plusxa0Mini(Qiagen公司制)从得到的细胞中萃取RNA,使用QutantiTectxa0Reversexa0Transcription(Qiagen公司制)转录得到cDNA。利用所得cDNA、QutantiTectPrimerAssay(Qiagen公司制)和iCyclerxa0iQ(Bio-RAD公司制),通过实时荧光定量PCR(real-timexa0PCR)对作为干扰素诱导基因的IFIT-1的mRNA进行定量。作为对照,使用下述对照用核酸转运用组合物,与上述同样地定量IFIT-1的mRNA,所述对照用核酸转运用组合物如下制备:以容量比1∶1混合用OptiMEM培养基将市售的常用作基因运载体的Lipofectaminexa02000^TM(Invitrogen公司制)稀释至0.1mg/mL的溶液、和用TE缓冲液以浓度为2μM稀释siRNA的siRNA溶液。用于定量校正的管家基因使用18rRNA。另外,作为空白,不添加核酸转运用组合物在上述条件下定量IFIT-1的mRNA。所得结果示于图4。使用DSPC的实施例4的核酸转运用组合物与使用Lipofect^TMxa0aminexa02000的对照用核酸转运用组合物相比,显示出明显低的干扰素诱导。上述结果表明通过使用本发明的核酸转运用组合物,可以抑制作为siRNA的副作用的干扰素诱导。